一、实验原理
蛋白提取试剂盒是通过温和裂解细胞或组织来释放总蛋白，运用特异性结合、离心分离及缓冲液洗脱等技术，有效去除杂质（如核酸、脂类等），最终获取高纯度和高活性的目标蛋白。
- 裂解：裂解液（含去污剂、蛋白酶抑制剂等）破坏细胞膜结构，释放胞内蛋白。
- 离心去除碎片：高速离心去除未裂解的细胞碎片、细胞核及大分子杂质。
- 蛋白纯化：通过离心柱或特异性结合树脂选择性吸附蛋白，杂质随废液排出。
- 洗脱：使用低盐缓冲液或去离子水洗脱目标蛋白，以避免变性。
二、材料准备
试剂盒：蛋白提取试剂盒（适用于各种动物、植物细胞和组织细菌样本）
自备材料：
- 新鲜样本（细胞、组织等）
- 预冷PBS缓冲液（货号：abs962）
- 离心机（可达到12,000xg）
- 冰盒或低温操作台
- 涡旋振荡器（货号：abs72001）
- BCA蛋白定量试剂盒（货号：abs9232）
- 液氮（组织样本需速冻）
三、实验步骤（裂解蛋白所有步骤都需在冰上或4℃进行）
- 样本处理：
- 细胞样本：离心收集细胞（1500xg, 3min），PBS洗涤2次，吸尽残留液体。
- 组织样本：切取10–50mg，液氮速冻后研磨成粉末。
- 裂解：
具体步骤参考不同提取试剂盒说明书。加入200-500μL预冷裂解液（含蛋白酶抑制剂），涡旋混匀。冰上裂解20-30分钟，每隔5分钟涡旋10秒。
- 离心去碎片：
在12,000xg和4℃下离心10分钟，取上清（即为总蛋白）转移至新离心管；核蛋白需先分离细胞核，低渗裂解后离心收集核沉淀，再溶解。
- 蛋白纯化：
将离心柱用平衡缓冲液预处理5分钟，离心弃废液；将裂解液上清加入离心柱，12,000xg离心1分钟，弃废液；加入洗涤缓冲液500μL，离心1分钟，重复2次。
- 洗脱蛋白：
加入50–100μL洗脱缓冲液，静置2分钟后离心1分钟，收集洗脱液（即目标蛋白）。
- 蛋白保存：
将提取的蛋白样品分装到小离心管中，短期保存在-20°C或长期保存在-80°C冰箱中，避免反复冻融。
四、结果分析
- 浓度测定：
使用BCA法测定蛋白浓度，OD562计算浓度（标准曲线法）。
- 纯度评估：
分光光度计检测A₂₆₀/A₂₈₀比值（理想值18–20，若超过20则提示有核酸残留）。
- 电泳验证：
SDS-PAGE电泳检测条带清晰度，无拖尾或杂带表明纯度较高。
五、常见问题及解决方案
| 问题 | 可能原因 | 解决方案 |
|---|---|---|
| 蛋白得率低 | 裂解不充分或蛋白酶降解 | 延长裂解时间，增加裂解液体积；确保添加蛋白酶抑制剂 |
| 洗脱液杂质多 | 洗涤步骤不彻底 | 增加洗涤次数或延长离心时间 |
| 蛋白浓度过高/过低 | 样本量不匹配或洗脱体积不当 | 调整样本量与裂解液比例，优化洗脱体积 |
| A₂₆₀/A₂₈₀比值异常 | 核酸或盐离子残留 | 增加洗涤次数，使用核酸酶预处理样本 |
| 电泳条带模糊 | 蛋白降解或SDS未充分结合 | 全程低温操作，电泳前煮沸样本5分钟 |
六、注意事项
- 全程低温操作（冰上或4℃环境），防止蛋白降解；
- 裂解液需现用现配，避免反复冻融；
- 组织样本需充分匀浆，避免未裂解细胞残留。
通过本方案，可高效提取高纯度蛋白，适用于Western Blot、ELISA、质谱分析等下游实验。选择尊龙凯时的蛋白提取试剂盒，进一步提升实验结果的可靠性与准确性。
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