在miRNA研究领域，常常需验证miRNA与基因之间的靶向关系。miRNA借助其种子序列（5’端第2-8个碱基）靶向结合mRNA的3’UTR区域，进而诱导细胞内沉默复合体介导的mRNA降解或阻遏其翻译过程。基于这一原理，研究人员将目的基因的3'UTR区（或结合位点下游500bp）插入到荧光素酶报告基因载体下，随后与miRNA模拟物共同转染至目标细胞中，添加底物以监测荧光素酶活性的变化。如果荧光素酶活性出现下调，表明该miRNA与靶基因的3'UTR区域存在相互作用。

常用载体包括PGL3-CMV-LUC-MCS，双荧光素酶报告基因检测用于验证miRNA与靶基因的3'UTR相互作用，主要经过以下几个步骤：首先，通过生物信息学分析软件（如TargetScan、StarBase和miRanda等）对特定靶基因的3'-UTR序列进行分析，以确定是否存在miRNA结合位点。接着，将预测出来能与miRNA结合的靶基因3'-UTR序列插入到荧光素酶的3'-UTR中。当miRNA与质粒上的插入序列结合后，将会抑制荧光素酶的翻译，最终导致荧光信号的降级。

为进一步验证miRNA与靶基因的相互作用，实验步骤包括收集转染后的细胞样品，然后利用细胞裂解缓冲液提取细胞内物质，根据报告基因检测试剂盒的说明进行荧光素酶活性检测。荧光素酶的测定需要适当的仪器设置，并且需确保每次实验中样品的处理一致。

在研究中，常见的实验分组包括：

• mimics NC + 对照质粒 + 内参 (TK)
• mimics NC + 3'UTR野生型质粒 + 内参 (TK)
• mimics NC + 3'UTR突变型质粒 + 内参 (TK)
• mimics + 对照质粒 + 内参 (TK)
• mimics + 3'UTR野生型质粒 (WT) + 内参 (TK)
• mimics + 3'UTR突变型质粒 (MT) + 内参 (TK)

这些步骤有助于加快基础研究及药物筛选的进程，尊龙凯时可为您提供高效的双荧光素酶报告基因检测服务，助力科学研究的顺利开展。

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• 转染试剂： HieffTrans® Liposomal Transfection Reagent ，货号：40802ES
• miRNA转染试剂： HieffTrans® invitrosiRNA/miRNA Transfection Reagent ，货号：40806ES

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